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科研實(shí)驗必備知識:一抗與二抗的區別

發(fā)布時(shí)間:2024-03-04     發(fā)布作者:上海通蔚生物

  一抗和二抗有什么區別?這是實(shí)驗室新手經(jīng)常問(wèn)的問(wèn)題。這里我們將從結合能力、用途與標記、來(lái)源、克隆性、預吸附五個(gè)角度來(lái)回答這個(gè)問(wèn)題。


  結合能力


  抗體 (Ab) 廣泛用于研究。根據其結合能力,抗體可分為兩類(lèi):一抗和二抗。具體來(lái)說(shuō),一抗是與蛋白質(zhì)或抗原 (Ag) 或您研究的任何物質(zhì)結合的抗體,而二抗是與一抗結合的抗體??聪聢D1

  

  圖 1 主要抗體 VS二抗體


  如果您讀過(guò)我們之前的文章什么是抗體?您將對抗體結構的良好了解,然后您會(huì )發(fā)現更容易理解一抗的 Fab 結構域與抗原結合并將其 Fc 結構域暴露給二抗,從而二抗的 Fab 結構域與一抗結合抗體的 Fc 結構域。


  由于給定物種中同類(lèi)的所有抗體分子的 Fc 結構域都是相同的,因此一種類(lèi)型的二抗能夠與多種類(lèi)型的一抗結合。例如,當在小鼠中產(chǎn)生的IgG類(lèi)抗體用作一抗時(shí),可以使用靶向小鼠IgG Fc結構域且不在小鼠中產(chǎn)生的抗體作為二抗。


  用途


  在免疫測定中,總是需要一抗來(lái)與靶抗原結合,但不一定使用二抗。我們以直接ELISA和間接ELISA為例。直接ELISA涉及直接標記,即一抗直接用酶標記進(jìn)行酶促反應和信號檢測,不需要二抗。間接ELISA不直接標記一抗,而是用酶標記二抗,如下圖2所示。




  圖 2 直接 ELISA 對比間接ELISA


  是否標記一抗(直接標記)或二抗(間接標記)取決于您的實(shí)驗。無(wú)論是直接標記還是間接標記都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。直接標記通常與簡(jiǎn)單的方案相關(guān),可以節省時(shí)間和試劑,沒(méi)有與二抗發(fā)生交叉反應的風(fēng)險,但缺乏信號放大和靈活性,并可能導致高背景。間接標記涉及信號放大,由于同一二抗可以與多種一抗反應,因此非常靈活,但具有相對復雜的方案和交叉反應風(fēng)險。


  來(lái)源


  抗體的來(lái)源是需要考慮的一個(gè)重要方面。一抗的宿主物種應與樣品的物種不同,以避免二抗與樣品免疫球蛋白發(fā)生交叉反應。此外,二抗的宿主物種應與一抗的宿主物種不同,因為二抗應針對一抗的物種。


  例如,如果您研究小鼠樣本,您將需要在小鼠以外的動(dòng)物中產(chǎn)生的一抗,例如在兔子中產(chǎn)生的一抗。然后,如果您使用針對小鼠的兔抗體作為一抗,您將需要在兔以外的動(dòng)物中產(chǎn)生的二抗,例如在山羊中產(chǎn)生的二抗。


  為了能夠檢測目標抗原,二抗不僅應當對一抗的種類(lèi)具有特異性,而且還應當對一抗的同種型具有特異性。例如,如果一抗是在兔體內產(chǎn)生的 IgG1 抗體,您將需要可以與兔 IgG1 抗體反應且不是在兔體內產(chǎn)生的二抗。


  克隆性


  一抗可以是單克隆抗體 (mAb) 或多克隆抗體 (pAb)。


  我們首先比較一下單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體僅識別抗原上的一個(gè)表位,而多克隆抗體識別抗原上的多個(gè)表位。因此,單克隆抗體和多克隆抗體具有不同的性質(zhì)和用途。單克隆抗體具有高特異性和高重現性,與多克隆抗體相比,染色背景更少。然而,由于其高特異性,當抗原的化學(xué)處理改變目標表位時(shí),單克隆抗體可能無(wú)法發(fā)揮作用。相比之下,多克隆抗體具有高親和力,能夠耐受抗原的微小變化,并且可以進(jìn)行更穩健的檢測。但多克隆抗體具有較高的批次間變異性,并且更有可能通過(guò)染色產(chǎn)生高背景。


  如果您的實(shí)驗需要高特異性,使用單克隆抗體作為一抗可能是一個(gè)不錯的選擇。如果陽(yáng)性信號較弱,請嘗試多克隆抗體。由于多克隆抗體可識別多個(gè)表位,因此它們更有可能在免疫沉淀 (IP) 和染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP) 中提供更好的結果。但如果你想探測抗原的特定域,多克隆抗體就沒(méi)有用了,單克隆抗體作為一抗可能會(huì )更好。


  二抗可以是與一抗或其片段結合的單克隆抗體或多克隆抗體。二抗有不同形式。首先,二抗可以針對一抗的整個(gè)分子。例如,一抗通常是 IgG 同種型。然后,您需要抗 IgG H&L(重鏈和輕鏈)抗體作為二抗,它與 IgG 一抗的重鏈和輕鏈發(fā)生反應。此外,這種抗 IgG H&L 抗體還會(huì )與一抗物種的其他免疫球蛋白類(lèi)別(例如 IgM IgA)發(fā)生反應,因為給定物種中的所有免疫球蛋白都具有相同的輕鏈。其次,二抗可以對一抗的 Fab 區具有特異性。同樣,這種形式的二抗也與重鏈和輕鏈反應,因此與具有相同輕鏈的其他免疫球蛋白類(lèi)別反應。第三,二抗可以對一抗的 Fc 區具有特異性,這意味著(zhù)它僅與重鏈反應。因此,該二抗僅與一類(lèi)免疫球蛋白發(fā)生反應,例如 IgG IgM。最后,二抗可以對一抗的輕鏈具有特異性,因此它將與具有相同輕鏈的所有免疫球蛋白類(lèi)別發(fā)生反應。關(guān)于單克隆和多克隆,可以參考這篇文章《蛋白質(zhì)免疫測定:認識多克隆抗體和單克隆抗體


  5、預吸附


  二抗有時(shí)需要額外的純化過(guò)程,稱(chēng)為預吸附,以提高特異性并最大限度地減少非特異性。在預吸附過(guò)程中,含有二抗的溶液通過(guò)含有來(lái)自潛在交叉反應物種(例如樣品物種)的固定血清蛋白或免疫球蛋白的柱基質(zhì)。通過(guò)這個(gè)過(guò)程,溶液中的非特異性抗體將被去除,而高度特異性的二抗被留下。例如,如果您使用小鼠組織,請選擇已吸附小鼠血清或小鼠 IgG 的二抗。


  預吸附的二抗產(chǎn)生較少的非特異性結合,因此不太可能產(chǎn)生非特異性背景。當您在多重標記實(shí)驗中測定蛋白質(zhì)表達或研究富含免疫球蛋白的組織或細胞時(shí),建議您使用預吸附二抗。


  綜上所述,一抗和二抗之間存在一些差異。首先,一抗和二抗具有不同的結合能力。一抗與檢測到的抗原結合,而二抗與一抗(通常是其 Fc 結構域)結合。其次,免疫分析中總是需要一抗,而二抗則不一定需要,這取決于實(shí)驗方法(直接或間接標記)。第三,產(chǎn)生的一抗的物種與樣品不是同一物種,產(chǎn)生的二抗的物種與一抗的物種來(lái)源不同。第四,一抗和二抗都可以是單克隆或多克隆,但克隆性的選擇需要考慮不同的因素。最后,二抗有時(shí)需要預吸附,而一抗一般不需要。


  現在,您可能會(huì )更好地了解一抗和二抗之間的差異,并會(huì )發(fā)現更容易為您的實(shí)驗選擇正確的抗體。選擇正確的抗體從來(lái)都不是一件容易的事。如果您選擇的抗體不適合您的實(shí)驗,您可能會(huì )浪費金錢(qián)、時(shí)間和寶貴的樣品。如果您對一抗和二抗還有疑問(wèn),歡迎前來(lái)咨詢(xún)。