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elisa實(shí)驗結果不準確?掌握這3大因素讓實(shí)驗結果更可靠!

發(fā)布時(shí)間:2024-04-19     發(fā)布作者:通蔚生物

  酶聯(lián)免疫吸附試劑盒,英文縮寫(xiě)elisakit,中文也叫ELISA試劑盒或ELISA檢測試劑盒。是酶聯(lián)免疫分析中常用的方法。ELISA基本原理是抗原(或抗體)與固相載體表面結合并保持其免疫活性??乖ɑ蚩贵w)與酶連接成為酶標抗原(或抗體),酶標抗原(或抗體)既保留了其免疫活性又保留了其酶活性。


  ELISA實(shí)驗中,待測標本(抗體或抗原)和酶標抗原(或抗體)在不同的步驟中與固相載體表面的抗原或抗體發(fā)生反應。將在固相載體上形成的抗原抗體復合物通過(guò)洗滌的方法與其他物質(zhì)分離,最后與固相載體結合的酶的量與標本中待檢測的抗體或抗原的量成正比。然后加入酶反應底物,底物在酶的催化下變成有色產(chǎn)物,根據顯色反應的深度進(jìn)行定性或定量分析,了解待測樣品中抗體或抗原的含量。


  


  ELISA在科研中應用比較廣泛。但ELISA實(shí)驗操作也一定的技術(shù)要求,通常在ELISA實(shí)驗中會(huì )遇到一些問(wèn)題,比如錯誤結果(既假陽(yáng)性或陰性的結果)。這些錯誤結果往往會(huì )影響科研進(jìn)展。了解影響ELISA結果因素非常有必要,下面通蔚生物為大家總結錯誤結果常見(jiàn)的三大因素:


  1、樣本因素


  2、試劑因素


  3、操作因素


  一、樣本因素


  可用于ELISA檢測的標本廣泛:體液(如血清、血漿、腦脊液)、分泌物(唾液)、排泄物(如尿液、糞便)均可作為標本測定抗體或抗原成分。有些標本可以直接測量(如血清、尿液),而另一些則需要預處理(如糞便和某些分泌物)。


  血清是ELISA檢測中最常用的樣本。血漿通常被視為與血清相同的樣本。標本引起的假陽(yáng)性、假陰性結果主要是由干擾物質(zhì)引起的,干擾物質(zhì)分為內源性物質(zhì)和外源性物質(zhì):


  內源性物質(zhì)


  有研究提示,約40%的人血清樣本中含有非特異性干擾物質(zhì),會(huì )不同程度地影響檢測結果。


  常見(jiàn)干擾物質(zhì):類(lèi)風(fēng)濕因子、補體、嗜異性抗體、靶抗原自身抗體、醫源性誘導的抗小鼠Ig(s)抗體、交叉反應物質(zhì)等。


  1、類(lèi)風(fēng)濕因子


  人血清中的IgMIgG型類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)可以直接與ELISA系統中的FC片段結合,FC片段可以捕獲抗體和酶標二抗導致假陽(yáng)性。


  2、補體


  在ELISA系統中固體一抗和標記二抗的過(guò)程中,抗體分子發(fā)生變構。C1q分子,是抗體分子FC片段的互補體,其結合位點(diǎn)是暴露的。C1q可以將兩者結合起來(lái),導致誤報。


  3、異嗜性抗體


  人血清含有與嚙齒類(lèi)動(dòng)物(例如鼠類(lèi)等)Ig結合的天然異嗜性抗體,可以在ELISA系統中連接一抗和二抗,也可能導致假陽(yáng)性。


  4、針對目標抗原的自身抗體


  靶抗原的自身抗體,例如抗甲狀腺球蛋白和抗胰島素,有時(shí)會(huì )與靶抗原結合形成復合物,從而干擾ELISA方法中的抗原抗體測定結果。


  5、醫源性誘導的抗小鼠Ig(s)抗體


  鼠源CD3等單克隆抗體的臨床應用、放射性同位素標記的鼠源抗體影像診斷、靶向治療等新技術(shù)可能會(huì )導致這些患者體內產(chǎn)生抗鼠抗體。此外,被大鼠等嚙齒類(lèi)動(dòng)物咬傷的患者體內也可產(chǎn)生抗小鼠Ig(s)抗體。這些患者在進(jìn)行ELISA檢測時(shí)可能會(huì )產(chǎn)生假陽(yáng)性。


  6、交叉反應物質(zhì)


  地高辛類(lèi)、AFP類(lèi)物質(zhì)等可與靶抗原發(fā)生交叉反應。當用多克隆抗體測定抗原時(shí),測定結果不會(huì )受到太大影響。然而,當用單克隆抗體測定抗原時(shí),如果交叉抗原決定簇恰好是所用單克隆抗體對應的目標決定簇,則可能會(huì )出現假陽(yáng)性結果。


  7、其他物質(zhì)


  血脂、膽紅素、血紅蛋白過(guò)高、血液粘度過(guò)高等都會(huì )對ELISA結果產(chǎn)生干擾作用。


  外源性物質(zhì)


  外源性物質(zhì)的影響常常是由于用于ELISA測定的血樣采集和保存不當造成的。如標本溶血、標本被細菌污染、標本保存時(shí)間過(guò)長(cháng)、標本凝集不完全、采血管內添加物的影響等。


  1、標本溶血


  各種人為因素引起的標本溶血,紅細胞被破壞時(shí),可釋放出大量具有過(guò)氧化物酶活性的血紅蛋白。在辣根過(guò)氧化物酶標記的ELISA測定中,會(huì )導致非特異性顯色,從而干擾測定結果。為了克服上述干擾效應,采集標本時(shí)必須避免溶血。


  2、標本被細菌污染


  由于細菌可能含有內源性辣根過(guò)氧化物酶,被細菌污染的標本與溶血標本一樣,也會(huì )產(chǎn)生非特異性顯色,干擾測量結果。


  3、標本保存不當


  冰箱保存時(shí)間較長(cháng)的標本,血清中的IgG可聚合成多聚體,AFP可形成二聚體,導致ELISA背景過(guò)高,甚至間接ELISA出現假陽(yáng)性。標本放置時(shí)間過(guò)長(cháng)(超過(guò)1天),有時(shí)抗原或抗體的免疫反應性減弱,可能出現假陰性。


  為了克服上述干擾,ELISA測定的血清樣品應新鮮采集。如不立即測定,5天內測定的血清樣本可在2-8℃保存,-20℃不超過(guò)1個(gè)月,-80℃不超過(guò)2個(gè)月。標本凍存后溶解,蛋白質(zhì)部分濃縮且分布不均勻。測定前應將蛋白質(zhì)充分混合。但混合時(shí)應輕柔,不宜劇烈振蕩。


  4、標本凝集不完全


  在沒(méi)有促凝劑和抗凝劑的情況下,正常血液在采集后0.52小時(shí)開(kāi)始凝固,并在1824小時(shí)完全凝固。如果在血液未完全凝固時(shí)離心血清,部分纖維蛋白原殘留在血清中,ELISA測定時(shí)會(huì )形成肉眼可見(jiàn)的纖維蛋白塊,容易造成假陽(yáng)性結果。因此,血樣采集后,必須充分凝固后分離血清,或者用采血管采集標本,并在采血管中加入分離膠或合適的凝固劑。


  5、樣品管內添加物質(zhì)的影響


  抗凝劑(如肝素)、酶抑制劑(如NaN3可抑制ELISA系統中辣根過(guò)氧化物酶活性)、快速血清分離膠等均可干擾ELISA測定。


  綜合上述,如果大家在ELISA實(shí)驗過(guò)程出現假陽(yáng)性或者假陰性結果,大家可以先從標本因素來(lái)去分析,采取相應的措施消除干擾,從而獲得正確、可靠的結果。


  試劑因素


  目前,市場(chǎng)上的elisa試劑盒良莠不齊,質(zhì)量不高的試劑盒質(zhì)量將會(huì )對影響elisa檢測的準確性。因此,選擇合適的試劑盒是非常重要的!


  ELISA試劑盒的用途,如檢測范圍、檢測樣本、應用種類(lèi)等;試劑盒的質(zhì)量控制,例如特異性、敏感性和重現性;客戶(hù)對試劑盒套件的驗證,例如文獻參考,以及套件的有效期,是我們需要考慮的主要因素。


  1、檢測范圍


  試劑盒的檢測范圍為標準曲線(xiàn)的范圍。特別注意待測樣品的濃度是否落在標準曲線(xiàn)范圍內。對于濃度較高的樣品,可以先進(jìn)行初步實(shí)驗,找到良好的稀釋倍數,然后進(jìn)行大量測量。在此之前,我們可以將ELISA試劑盒中給出的樣本值與NCBI文獻中給出的蛋白表達參考值uniprotpax-dab進(jìn)行比較。


  2、應用種類(lèi)


  一般來(lái)說(shuō),不同物種的ELISA試劑盒不通用,除非試劑盒中有特別說(shuō)明。


  3、測試樣品


  對于ELISA試劑盒,常見(jiàn)的待測樣品類(lèi)型有:血清和血漿(不同的抗凝劑)、細胞上清液和細胞裂解物。ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)中詳細說(shuō)明了待測樣品的類(lèi)型和稀釋液,請注意不同樣品的稀釋液不要混合。


  4、特異性


  ELISA試劑盒的特異性與試劑盒的關(guān)鍵成分——抗體(對)有關(guān)。該試劑盒用于篩選靶向抗體材料,經(jīng)過(guò)嚴格控制,保證了試劑盒的特異性。


  5、靈敏度


  ELISA靈敏度反映了試劑盒檢測最小量待測物質(zhì)的能力。您可以根據樣品中待測指標的多少來(lái)選擇合適的試劑盒。如果待測指標量很低,一般試劑盒無(wú)法滿(mǎn)足要求,可以選擇高靈敏度ELISA試劑盒。


  6、重復性


  科學(xué)實(shí)驗注重可重復性。對于一般ELISA試劑盒,板內和板間變異系數應控制在15%以?xún)?。?/span>CUSABIOELISA試劑盒中,大多數板內變異系數小于8%,板間變異系數小于10%。


  7、文獻引用


  產(chǎn)品文獻引用,尤其是高質(zhì)量SCI文章的引用,是很多客戶(hù)關(guān)心的問(wèn)題。這是產(chǎn)品識別的一個(gè)非常重要的指標,對于相關(guān)用戶(hù)的研究具有一定的參考作用。CUSABIOELISA試劑盒的客戶(hù)參考文獻已達4500余篇,并且每年以數百種的速度增長(cháng)。


  8、有效期


  一般情況下,試劑盒的有效期為半年,在制備樣品時(shí)需要考慮試劑盒的有效期。


  操作因素


  ELISA技術(shù)具有較高的靈敏度和特異性,在生物學(xué)研究中得到廣泛認可,在臨床檢測中也得到廣泛應用。對于初學(xué)者來(lái)說(shuō),如果在實(shí)驗操作過(guò)程中不注意ELISA的所有步驟,可能會(huì )對最終的實(shí)驗結果產(chǎn)生比較大的影響,如板白、顯色弱、靈敏度低、花板現象、無(wú)梯度和高ELISA背景。


  綜上所述,在ELISA實(shí)驗中應嚴格遵循ELISA操作規程,并注意以下問(wèn)題:


  A.試劑保存:蛋白抗體試劑短期不用時(shí)可保存在-20℃,顯色底物溶液的洗滌液保存在2-8℃。


  b.終止反應時(shí)盡量避免微孔中出現氣泡。


  C.酶標儀讀數應在反應終止后5分鐘內完成。


  提前準備試劑


  A.預涂酶標板和各試劑組分需要在室溫下平衡30分鐘以上。


  b.試劑使用前應充分混勻,以保證試劑的均勻性和準確性。


  C.普通洗滌液是濃縮液,需要提前稀釋?zhuān)?/span>pH值應保持在7.27.4之間。


  d.一般檢測抗體和酶標二抗需要用相應的稀釋度稀釋至工作濃度。


  e.不同批次的試劑不能混合,并應檢查各組分的有效性。


  添加測試樣本


  A.如果檢測樣品過(guò)多,建議分批操作。


  b.需要稀釋的樣品應提前稀釋。請參閱使用說(shuō)明書(shū)選擇合適的稀釋劑。


  C.控制上樣時(shí)間,避免上樣時(shí)間過(guò)長(cháng)造成誤差。


  d.注意加樣角度。垂直添加到板底部,不要接觸ELISA板壁。


  e.一份樣品,一個(gè)移液器吸頭。防止交叉污染。


  孵育和洗滌


  A.孵育時(shí)間和溫度按照試劑盒中的說(shuō)明進(jìn)行。


  b.在水浴或濕盒中孵育以避免邊緣效應。


  C.注意洗滌次數、洗滌液的用量、洗滌液浸泡的時(shí)間長(cháng)短、洗滌的強度。


  d.手洗ELISA板時(shí),請將板垂直,避免交叉污染;力不能太強以防止抗原-抗體復合物脫離。


  e.用洗板機洗板時(shí),要經(jīng)常檢查沖洗頭是否暢通。


顯色


  顯色反應需要避光,在37℃或室溫下反應1530分鐘。


  讀取與數據分析


  終止反應時(shí)盡量避免微孔中出現氣泡。


  酶標儀讀數應在反應終止后5分鐘內完成。


  酶標儀應提前預熱1530分鐘。


  數據分析一般采用四參數、直線(xiàn)擬合法進(jìn)行;標準曲線(xiàn)的相關(guān)系數(R2)可用于確定選擇哪種擬合方法。R2一般需要大于0.99,可以點(diǎn)擊這里查看ELISA數據分析方法。


試劑保存


  A.短期不用的蛋白質(zhì)和抗體試劑保存在-20℃。


  b.顯色液和洗滌液儲存于2-8℃。


  上述為大家介紹影響酶聯(lián)免疫試劑盒的結果的因素,當ELISA結果不理想的時(shí)候,綜合上述3種因素考慮,從而提高實(shí)驗的準確性。如果您還有疑問(wèn),可以和我們在線(xiàn)ELISA顧問(wèn)尋求幫助!如果考慮ELISA試劑盒,上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司擁有15年以上的ELISA試劑盒生產(chǎn)經(jīng)驗,搭建了ELISA試劑盒開(kāi)發(fā)和成熟抗原-抗體系統的良好平臺??商峁?/span>4000多種ELISA試劑盒,主要采用夾心法和競爭法,覆蓋3000個(gè)靶標,涉及小鼠、大鼠、牛、兔、豬等20多個(gè)種類(lèi)。