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避免實(shí)驗誤區:ELISA 試劑盒使用方法及注意事項

發(fā)布時(shí)間:2024-05-09     發(fā)布作者:上海通蔚生物

  ELISA試劑盒又叫酶聯(lián)免疫試劑盒,在生物實(shí)驗,是一種高敏感、特異性強,重復性好等檢測優(yōu)勢廣泛應用在免疫學(xué)檢驗各個(gè)領(lǐng)域中。對于ELISA試劑盒使用,有些科研小伙伴們有些不解,今天由上海通蔚生物為大家介紹一下ELISA試劑盒使用方法。我們從實(shí)驗前準備、實(shí)驗步驟和結果分析及注意事項加以說(shuō)明。


  1、試驗前準備


  2、實(shí)驗步驟


  4、注意事項

酶聯(lián)免疫試劑盒

圖1 通蔚ELISA試劑盒

  實(shí)驗前準備


  閱讀說(shuō)明書(shū)。在進(jìn)行ELISA實(shí)驗前,要充分了解ELISA說(shuō)明書(shū),了解實(shí)驗原理、操作步驟及注意事項!


  準備實(shí)驗材料。通過(guò)閱讀說(shuō)明書(shū),準備接下來(lái)ELISA實(shí)驗所需的器材及試劑。比如常見(jiàn)有酶標板、抗體(一抗和二抗)、酶標抗體和底物、封閉液、終止液和酶標儀等。


  復溫試劑。在實(shí)驗之前,需要將試劑進(jìn)行復溫操作,可以保證試劑的穩定性和實(shí)驗結果的準確性,在開(kāi)始實(shí)驗之前,應將試劑盒從冰箱中取出,室溫放置15-30分鐘,使試劑恢復至室溫。


  配置洗滌液。洗滌液在ELISA實(shí)驗中起到去除未結合的物質(zhì),減少背景干擾的重要作用。一般有2種方式:


  方式一:使用濃縮洗滌液。大多數ELISA試劑盒會(huì )提供濃縮洗滌液。你需要按照說(shuō)明書(shū)上的比例,用蒸餾水或去離子水稀釋濃縮液。


  方式二:使用洗滌液粉劑。一些ELISA試劑盒會(huì )提供洗滌液粉劑。你需要按照說(shuō)明書(shū)上的指示,將粉劑溶解于一定量的蒸餾水或去離子水中,并充分攪拌至完全溶解。


  不管采用上述哪種方式,其都要遵循說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配置,并嚴格按照說(shuō)明進(jìn)行操作,以確保實(shí)驗結果的準確性和可靠性。


  準備酶標儀:打開(kāi)酶標儀預熱,設置檢測波長(cháng)。

酶標儀

圖2 酶標儀

  實(shí)驗步驟


  ELISA實(shí)驗步驟通常有包被、洗滌、封閉、洗滌、加樣、洗滌、加酶標抗體、洗滌、顯色、終止反應和測定吸光度值。接下來(lái)以小鼠1-磷酸鞘氨醇(S1P)ELISA試劑盒步驟說(shuō)明使用方法。


  實(shí)驗原理


  試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包被小鼠1-磷酸鞘氨醇(S1P)捕獲抗體的包被微孔中,依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體,經(jīng)過(guò)溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠1-磷酸鞘氨醇(S1P)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長(cháng)下測定吸光度(OD值),計算樣品濃度。elisa實(shí)驗原理,可以參考《一文讀懂酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(ELISA)原理及步驟

elisa試劑盒原理

圖3 ELISA試劑盒原理


  試劑準備


  小鼠脂肪酸合成酶抑制劑(FASI)試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡后方可使用。


  20×洗滌緩沖液的稀釋?zhuān)赫麴s水按120稀釋?zhuān)?/span>120×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。


  操作步驟:


  1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。


  2.設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;


  3.樣本孔中加入待測樣本50μL;空白孔不加。


  4.除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。


  5.棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿(mǎn)洗滌液(350μL),靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板)。


  6.每孔加入底物A、B50μL,37℃避光孵育15min。


  7.每孔加入終止液50μL,15min內,在450nm波長(cháng)處測定各孔的OD值。


  實(shí)驗結果計算


  以所測標準品的OD值為橫坐標,標準品的濃度值為縱坐標,在坐標紙上或用相關(guān)軟件繪制標準曲線(xiàn),并得到直線(xiàn)回歸方程,將樣品的OD值代入方程,計算出樣品的濃度。


  注意事項


  1.嚴格按照規定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。


  2.洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體。溫育過(guò)程中不要讓微孔干燥掉。


  3.消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。


  4.底物顯色液應呈無(wú)色或很淺的顏色,已經(jīng)變藍的底物液不能使用。


  5.避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。


  6.在儲存和溫育時(shí)避免強光直接照射。


  7.平衡至室溫后再打開(kāi)密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。


  8.任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會(huì )破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。


  9.不能使用過(guò)期產(chǎn)品。


  10.如果可能傳播疾病,所有的樣品都應管理好,按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。


  上述為大家介紹了ELISA試劑盒使用方法,文中采用是小鼠1-磷酸鞘氨醇(S1P)ELISA試劑盒,不同的試劑盒操作步驟有所差異,大家可以根據自己試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行對照操作。ELISA 試劑盒為科研和臨床診斷提供了方便快捷的檢測工具。通過(guò)正確使用 ELISA 試劑盒,可以獲得準確可靠的實(shí)驗結果。