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ELISA檢測試劑盒:一文讀懂其原理與應用

發(fā)布時(shí)間:2024-05-10     發(fā)布作者:上海通蔚生物

  ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)是一種基于抗原抗體特異性結合的免疫學(xué)檢測方法,用于定量或定性檢測生物樣品中各種靶標物質(zhì),包括蛋白質(zhì)、抗體、激素、肽類(lèi)等。


  ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定) 是一種用于檢測液體樣品中靶向蛋白質(zhì)的固相酶免疫測定 (EIA) 技術(shù)。在 ELISA 中,首先將靶向蛋白質(zhì)(抗原)固定在固相載體表面,例如微孔板。然后,加入含有待測抗體的樣品,并與固定的抗原進(jìn)行結合。未結合的抗體會(huì )被洗滌去除。隨后,加入酶標二抗,該二抗能夠特異性識別結合在抗原上的抗體。最后,加入底物溶液,底物會(huì )在酶的催化下發(fā)生顯色反應,顏色深淺與樣品中靶向蛋白質(zhì)的濃度成正比,通過(guò)檢測顏色的變化即可定量或定性分析樣品中靶向蛋白質(zhì)的含量。


  ELISA試劑盒自從60-70年代問(wèn)世以來(lái),得到全世界科研工作者的認可及推崇,在歐美及中國獲得很大的推廣,尤其是國內生化領(lǐng)域的長(cháng)足發(fā)展。


  ELISA生物實(shí)驗敏感性高,特異性強,重復性好的實(shí)驗診斷方法。由于其試劑穩定、易保存,操作簡(jiǎn)便,結果判斷較客觀(guān)等因素,已廣泛應用在免疫學(xué)檢驗的各領(lǐng)域中。ELISA一直被用作植物病理學(xué)、醫學(xué)和生物技術(shù)的重要工具之一。它是許多行業(yè)對其生物產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量檢查的首選檢測方法。在96孔板中進(jìn)行,可以在一次實(shí)驗中測量和研究多個(gè)樣品。它與其他抗體測定不同,因為它的數據再現性和定量結果。


  本文討論了酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)的工作原理、其類(lèi)型、優(yōu)點(diǎn)和局限性及其在生命科學(xué)實(shí)驗室和工業(yè)中的應用。


  酶聯(lián)免疫吸附測定原理


  ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)的工作原理基于抗原抗體之間的特異性結合??贵w是生物體免疫系統產(chǎn)生的蛋白質(zhì),用于識別和結合特定的抗原,而抗原則可以是來(lái)自任何外來(lái)來(lái)源的分子,例如蛋白質(zhì)、多肽、病毒等。


  在ELISA實(shí)驗中,通常使用特殊的固相載體,例如聚苯乙烯微孔板,其表面可以吸附抗原或抗體。大多數情況下,抗原會(huì )被固定在微孔板表面,然后加入含有待測抗體的樣品。如果樣品中存在與抗原特異性結合的抗體,則會(huì )與固定的抗原結合。未結合的抗體會(huì )被洗滌去除。隨后,加入酶標二抗,該二抗能夠特異性識別結合在抗原上的抗體。最后,加入底物溶液,底物會(huì )在酶的催化下發(fā)生顯色反應。顏色深淺與樣品中靶向抗原的濃度成正比,通過(guò)檢測顏色的變化即可定量或定性分析樣品中靶向抗原的含量。

ELISA試劑盒工作原理

圖1 elisa檢測原理


  ELISA試劑盒類(lèi)型


  ELISA分為常見(jiàn)4種類(lèi)型,分別是直接ELISA法、間接ELISA法、夾心ELISA法和競爭ELISA法。


  直接ELISA


  直接ELISA法是一種簡(jiǎn)單快速的ELISA方法,其原理是將抗原或蛋白質(zhì)直接固定在固相載體表面,例如微孔板。然后,加入酶標抗體溶液,該抗體能夠特異性識別和結合固定的抗原。未結合的抗體會(huì )被洗滌去除。隨后,加入底物溶液,底物會(huì )在酶的催化下發(fā)生顯色反應。顏色深淺與樣品中靶向抗原的濃度成正比,通過(guò)檢測顏色的變化即可定量或定性分析樣品中靶向抗原的含量。


  雖然直接ELISA法操作簡(jiǎn)單,但由于其只使用一種抗體,因此特異性可能較低,容易產(chǎn)生較高的背景信號,即更高的顯色或光密度讀數,這可能會(huì )影響實(shí)驗結果的準確性。


直接ELISA

圖2 直接ELISA法


  間接ELISA


  間接ELISA法的步驟與直接ELISA法相似,但增加了一個(gè)使用酶標二抗進(jìn)行檢測的步驟,從而提高了檢測的靈敏度。在間接ELISA法中,首先將抗原或蛋白質(zhì)固定在微孔板的孔中。然后,加入含有待測抗體(一抗)的樣品,并與固定的抗原進(jìn)行結合。未結合的一抗會(huì )被洗滌去除。


  隨后,加入酶標二抗,該二抗能夠特異性識別并結合一抗。加入底物溶液后,底物會(huì )在酶的催化下發(fā)生顯色反應。顏色深淺與樣品中靶向抗原的濃度成正比,通過(guò)檢測顏色的變化即可定量或定性分析樣品中靶向抗原的含量。


  相比于直接ELISA法,間接ELISA法具有更高的靈敏度和更廣泛的應用范圍,因為可以使用多種不同的二抗進(jìn)行檢測。

間接ELISA

圖2 間接LEISA法


  夾心ELISA


  夾心ELISA法是實(shí)驗室中最常用的ELISA類(lèi)型之一,其靈敏度和特異性都較高。在夾心ELISA法中,首先將捕獲抗體固定在微孔板的孔中。然后,加入含有待測抗原的樣品,并與捕獲抗體進(jìn)行結合。未結合的抗原會(huì )被洗滌去除。


  隨后,加入檢測抗體,該抗體能夠識別抗原上的不同表位,并與之結合。檢測抗體通常帶有酶標或熒光標記。最后,加入底物溶液,底物會(huì )在酶的催化下發(fā)生顯色反應或熒光反應。信號強度與樣品中靶向抗原的濃度成正比,通過(guò)檢測信號的變化即可定量或定性分析樣品中靶向抗原的含量。


  夾心ELISA法的優(yōu)勢在于其使用了兩種抗體來(lái)識別抗原,從而提高了檢測的特異性和靈敏度,降低了背景信號的干擾。

競爭ELISA

圖3 夾心ELISA法


  競爭法ELISA


  競爭ELISA法主要用于檢測小分子抗原,其原理與其他ELISA方法有所不同。在競爭ELISA法中,首先將抗原或抗原類(lèi)似物固定在微孔板的孔中。然后,將待測樣品與酶標抗原或抗原類(lèi)似物混合,并加入到微孔板中。樣品中的抗原與酶標抗原競爭性地與固定的抗原或抗原類(lèi)似物結合。


  未結合的抗原和抗體會(huì )被洗滌去除。隨后,加入底物溶液,底物會(huì )在酶的催化下發(fā)生顯色反應。如果樣品中靶向抗原的濃度較高,則會(huì )與更多的酶標抗原競爭結合位點(diǎn),導致酶標抗原的結合量減少,顯色反應較弱,信號強度較低。相反,如果樣品中靶向抗原的濃度較低,則酶標抗原的結合量會(huì )增加,顯色反應較強,信號強度較高。


  通過(guò)檢測信號強度與標準曲線(xiàn)的比較,可以定量分析樣品中靶向抗原的含量。競爭ELISA法的優(yōu)勢在于可以檢測小分子抗原,并且不需要制備針對小分子抗原的抗體。


  ELISA試劑盒檢測步驟


  以下是進(jìn)行ELISA實(shí)驗的一般步驟。但需要根據具體實(shí)驗進(jìn)行調整:


  準備工作


  準備包被緩沖液、封閉緩沖液、洗滌緩沖液、抗體溶液、底物溶液和終止液。


  將試劑盒從冰箱中取出,恢復至室溫。


  打開(kāi)酶標儀預熱,設置檢測波長(cháng)。


  包被


  向微孔板的孔中加入100μL肽溶液(4μg/mL,用包被緩沖液稀釋)。


  將板在37℃下孵育2小時(shí)或在4℃下孵育過(guò)夜。


  封閉


  除去包被溶液,并用100μL洗滌緩沖液(PBS-0.05%Tween20)洗滌3次。


  用紙巾擦干板子。


  向每個(gè)孔中添加100μL封閉緩沖液(3%脫脂牛奶的PBS溶液)。


  將板在37℃下孵育1小時(shí)。


  加樣


  用洗滌緩沖液洗滌板子3次。


  向每個(gè)孔中添加50μL稀釋的一抗溶液(稀釋比例根據具體實(shí)驗確定)。


  將板在37℃下輕輕搖動(dòng)孵育1小時(shí)。


  洗滌


  重復洗滌步驟3次,每次使用100μL洗滌緩沖液。


  顯色


  向每個(gè)孔中添加50μL稀釋的酶標二抗溶液(稀釋比例根據具體實(shí)驗確定)。


  將板在37℃下孵育1小時(shí)。


  用洗滌緩沖液洗滌板子6次。


  將TMB底物溶液、乙酸和0.03%H2O2按照1:4:5的比例混合,制備顯色底物溶液。


  向每個(gè)孔中加入50μL顯色底物溶液。


  將板在37℃避光孵育15-30分鐘。


  終止反應


  顯色足夠后,向每個(gè)孔中添加100μL終止液。


  讀數


  使用酶標儀在指定的波長(cháng)下讀取每個(gè)孔的吸光度值。


  ELISA檢測的優(yōu)點(diǎn)和局限性


  優(yōu)點(diǎn):


  操作簡(jiǎn)便:ELISA實(shí)驗方案簡(jiǎn)單易行,只需進(jìn)行基本的實(shí)驗操作,即可完成檢測。


  高通量:現如今ELISA可以使用96孔板或384孔板進(jìn)行檢測,能夠同時(shí)處理大量樣品,提高檢測效率。


  靈敏度和特異性高:ELISA利用抗原抗體之間的特異性結合進(jìn)行檢測,可以檢測到樣品中微量的靶標物質(zhì),并具有較高的特異性,能夠區分目標物質(zhì)和其它相似物質(zhì)。


  適用樣品類(lèi)型廣泛:ELISA可以檢測各種類(lèi)型的樣品,例如血清、血漿、細胞和組織提取物、尿液、唾液等。


  定量分析:ELISA可以通過(guò)標準曲線(xiàn)定量分析樣品中靶標物質(zhì)的濃度,提供更精確的檢測結果。


  結果快速:ELISA實(shí)驗通??梢栽跀敌r(shí)內完成,能夠快速獲得檢測結果。


  成本效益高:ELISA試劑盒價(jià)格相對便宜,操作簡(jiǎn)單,無(wú)需昂貴的設備,因此具有較高的成本效益。


  局限性:


  結果易受影響:ELISA結果容易受到多種因素的影響,例如操作誤差、試劑質(zhì)量、樣品處理等,需要嚴格控制實(shí)驗條件,確保結果的準確性。


  半定量檢測:雖然ELISA可以進(jìn)行定量分析,但其準確性不如一些其他定量方法,例如質(zhì)譜法。


  信息有限:ELISA只能檢測靶標物質(zhì)的存在和含量,無(wú)法提供有關(guān)靶標物質(zhì)結構、功能等信息。


  交叉反應:某些情況下,抗體可能與樣品中的其他物質(zhì)發(fā)生交叉反應,導致假陽(yáng)性結果。


  背景信號:ELISA實(shí)驗中可能會(huì )出現背景信號,影響檢測結果的準確性,需要進(jìn)行適當的校正。


  Elisa試劑盒應用


  ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)作為一種靈敏、特異且用途廣泛的免疫學(xué)檢測方法,在生命科學(xué)、生物技術(shù)和醫學(xué)領(lǐng)域擁有廣泛的應用。以下列舉一些重要的應用領(lǐng)域:


  抗體和抗原檢測:ELISA可以用于檢測各種生物樣品中的抗體和抗原,例如血清、血漿、細胞培養上清液等。這使得ELISA成為研究免疫反應、疾病診斷和疫苗開(kāi)發(fā)的重要工具。


  傳染病診斷:ELISA是許多傳染病診斷的金標準方法,例如HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等。它可以檢測患者血清中的病毒抗原或抗體,幫助醫生進(jìn)行早期診斷和治療。


  疾病監測和流行病學(xué)研究:在疾病爆發(fā)期間,例如最近的COVID-19大流行,ELISA快速檢測試劑盒被廣泛用于評估疾病的傳播范圍和趨勢,為公共衛生決策提供重要數據。


  食物過(guò)敏原檢測:ELISA可用于檢測食品中的過(guò)敏原,例如花生、牛奶、雞蛋、堅果等,幫助食品生產(chǎn)商確保食品安全,并為過(guò)敏人群提供指導。


  自身免疫性疾病診斷:ELISA可用于檢測自身免疫性疾病相關(guān)的自身抗體,例如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節炎、系統性紅斑狼瘡等,幫助醫生進(jìn)行疾病診斷和監測。


  藥物研發(fā):ELISA在藥物研發(fā)過(guò)程中發(fā)揮著(zhù)重要作用,例如用于藥物篩選、藥代動(dòng)力學(xué)研究、毒理學(xué)研究等。

通蔚生物試劑盒

圖4 通蔚生物試劑盒


  最后,相信大家通過(guò)上文對ELISA試劑盒原理有所了解。通蔚提供多種經(jīng)濟實(shí)惠且有效的ELISA試劑盒,主要采用夾心法和競爭法,覆蓋3000個(gè)靶標,涉及小鼠、大鼠、牛、兔、豬等20多個(gè)種類(lèi)。