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二抗選擇:提高實(shí)驗結果準確性的關(guān)鍵

發(fā)布時(shí)間:2024-06-17     發(fā)布作者:上海通蔚生物

  在免疫學(xué)實(shí)驗中,通常會(huì )用到二抗,二抗通過(guò)與一抗結合,進(jìn)而與靶抗原結合,促進(jìn)靶分子的間接檢測。二抗在免疫學(xué)實(shí)驗中起著(zhù)舉足輕重的作用,二抗的選擇也決定整個(gè)實(shí)驗的成敗。了解一抗和二抗可以參考這篇文章《一抗和二抗簡(jiǎn)介

圖 1.直接與間接免疫測定



  二抗間接檢測優(yōu)勢


  提高靈敏度——多個(gè)二抗與單個(gè)一抗結合會(huì )導致信號放大。

  靈活性——通過(guò)與多個(gè)一抗配對,相同的二抗可以用于檢測多個(gè)目標。

  用途更廣泛——根據預期應用,相同的一抗可以與各種二抗配對(例如,用于蛋白質(zhì)印跡的HRP結合物和用于IF/FC的熒光結合物)。

  容易獲得——針對大多數物種的二抗可從多個(gè)商業(yè)供應商處以多種結合物選擇廣泛獲得。

  選擇二抗


  在應用中選擇合適的二抗取決于多種因素(如下所述),以確保高度靈敏和準確地檢測目標抗原。

  1.靶標特異性–二抗必須針對一抗的宿主物種產(chǎn)生。例如,如果一抗是在小鼠中產(chǎn)生的,則二抗必須是抗小鼠的,并且在小鼠以外的宿主物種中產(chǎn)生(例如,山羊抗小鼠二抗)。此外,二抗應該對一抗類(lèi)或亞類(lèi)具有特異性。由于大多數多克隆一抗是針對同種型IgG產(chǎn)生的,因此使用的二抗應該識別IgG重鏈和輕鏈(抗IgGH+L)。另一方面,單克隆一抗是針對特定IgG亞類(lèi)產(chǎn)生的,因此需要亞類(lèi)特異性二抗來(lái)檢測它們。

  2.克隆性——傳統上,抗體被分為多克隆抗體和單克隆抗體。多克隆二抗是識別同一抗原上不同表位的異質(zhì)抗體群,而單克隆二抗是識別抗原上相同表位的同質(zhì)抗體群。在決定抗體克隆性時(shí),選擇取決于預期應用的更重要因素——特異性或靈敏度。雖然單克隆二抗比多克隆抗體具有更好的特異性,并且是需要高度特異性靶標檢測的應用的首選(例如,用于檢測特定的小鼠同種型),但多克隆二抗比單克隆二抗靈敏得多,因此用于需要高靈敏度的應用(例如,用于檢測低豐度靶標)。

  3.宿主物種–宿主物種是指生產(chǎn)二抗的動(dòng)物。確保二抗宿主與生產(chǎn)一抗的宿主動(dòng)物不同非常重要。雖然大多數一抗是在兔子或老鼠體內生產(chǎn)的,但山羊是市售二抗最廣泛使用的宿主動(dòng)物。

  進(jìn)行多重實(shí)驗時(shí),雖然建議所有一抗均來(lái)自同一宿主物種,但使用的二抗應在同一宿主物種中產(chǎn)生。這有助于防止二抗與非目標物種的一抗之間發(fā)生交叉反應。

  4.抗體形式——二抗有多種形式,包括完整抗體和抗體片段。二抗形式的選擇取決于抗體的預期應用。例如,對于組織樣本中的IHC和IF,包括F(ab')2和Fab'的抗體片段比完整抗體更受歡迎,因為它們的尺寸更小,可以更好地穿透組織。此外,由于片段二抗缺乏Fc區,它們有助于消除Fc區與某些細胞類(lèi)型(B細胞、NK細胞、巨噬細胞和樹(shù)突狀細胞)上的Fc受體非特異性結合導致的高背景,從而使它們非常適合用于富含Fc受體的樣本。然而,需要記住的一點(diǎn)是,片段抗體的靈敏度低于完整抗體,因為它們的尺寸較小,可以結合更少的染料或酶分子。

  5.結合物類(lèi)型——二抗結合物的選擇主要取決于兩個(gè)因素:(i)二抗的應用,以及(ii)該應用中使用的檢測方法。例如,在進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗時(shí),雖然HRP標記的二抗用于化學(xué)發(fā)光檢測,但建議使用熒光染料標記的二抗進(jìn)行熒光檢測。下表根據預期應用和檢測方法重點(diǎn)介紹了建議的二抗結合物。


應用 二抗偶聯(lián)物
蛋白質(zhì)印跡
  • 酶標記二抗,例如用于化學(xué)發(fā)光檢測的 HRP 和用于比色檢測的 AP
  • 熒光標記的二抗可用于熒光檢測

免疫組織化學(xué)

  • 用于顯色 IHC 的酶標記二抗(例如 HRP 或 HRP 聚合物)
  • 用于信號放大的生物素化二抗
  • 用于熒光 IHC 的熒光標記二抗
免疫熒光
  • 熒光標記的二抗
  • HRP 標記的二抗可用于基于 TSA 的檢測
流式細胞
  • 熒光標記的二抗
  • 酶標記的二抗
  • 生物素化的二抗可與熒光標記的鏈霉親和素一起使用

酶聯(lián)免疫吸附試驗


  • 生物素標記的二抗
  • 酶標記的二抗



  6.交叉吸附抗體——交叉吸附二抗是傳統的多克隆二抗,經(jīng)過(guò)額外的純化步驟以消除與非目標物種的非預期IgG的交叉反應。當二抗與樣品中的內源性免疫球蛋白結合或在多路復用應用中與脫靶抗體結合時(shí),交叉反應可能導致高背景或非特異性信號。交叉吸附通過(guò)將親和純化的多克隆二抗通過(guò)含有固定化抗體或其他物種血清蛋白的柱子來(lái)幫助提高抗體特異性。這有助于捕獲柱中的非特異性抗體,同時(shí)允許在流過(guò)液中收集沒(méi)有交叉反應的抗體。

  好了,上述為大家介紹了二抗的選擇。如果你在免疫學(xué)實(shí)驗中經(jīng)常出現無(wú)法識別目標抗體、產(chǎn)生假陽(yáng)性結果、降低實(shí)驗靈敏度等因素,要留意歐聯(lián)二抗是否選對。當然,你可以結合文章介紹對應判斷,文章給大家一個(gè)參考。這里,通蔚也祝福您在免疫學(xué)實(shí)驗中提高實(shí)驗的成功率。